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VE Elisa Kit蛋白測(cè)序操作步驟

1 多肽鏈的拆分。VE Elisa Kit由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體;可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈(亞基).

2 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。

3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的β-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。

二硫鍵的切割與保護(hù)(元素后數(shù)字為下標(biāo))

a 過(guò)甲酸〔performic acid〕 不可逆

-CH2SO3H

b、還原+氧化 不可逆

[ 巰基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等

-S-CH2-COOH

c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

-R1-S-S-R2 + HSO3-

R1-S- + R2-S-SOH3

VE Elisa Kit可以通過(guò)加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價(jià)力;應(yīng)用過(guò)甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。

巰基(-SH)的保護(hù)

5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端

多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，zui重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法(Sanger法;Edman法;DNS-Cl;酶降解法)，C末端分析法(肼解法;酶降解法;硼氫化鋰法)。

6 多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段?？刹捎脙煞N或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開(kāi)來(lái)。

7 測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序

8 確定肽段在多肽鏈中的次序。

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置

VE Elisa Kit一般采用處理沒(méi)有斷開(kāi)二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過(guò)甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。

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